1锡----苯芴酮比色法
 
试样经消化后，在弱酸性溶液中四价锡离子与苯芴酮形成微溶性橙红色络合物，在保护性胶体存在下与标准系列比较定量。
1、酒石酸溶液(100 g/L)：  2、抗坏血酸溶液(10 g/L):临用时配制。3、动物胶溶液(5 g/L):临用时配制。
4、酚酞指示液(10 g/L):用乙醇溶解。 5、氨水(1+1)
6、硫酸(1+9):      7、苯芴酮溶液(0.1g/L):称取0.020 g苯芴酮（1,3,7一三羟基一9一苯基蒽醌)，加少量甲醇及硫酸（1+9）数滴溶解，以甲醇稀释至200 mL。
8、锡标准使用液（10.0ppm）：
吸取 1.00mL-5.00mL试样消化液和同量的试剂空白溶液，分别置于25mL比色管中。
吸取 0, 0.20,0.40,0.60,0.80,1.00 mL锡标准使用液(相当0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0ug锡)，分别置于25mL比色管中。
于试样、消化液、试剂空白液及锡标准液中各加0.5 mL酒石酸溶液(100g/L)及1滴酚酞指示液，混匀，各加氨水(1+1)中和至淡红色，加3 mL硫酸(1+9),1mL动物胶溶液及2.5 mL抗坏血酸溶液，再加水至25mL_，混匀，再各加2 mL苯芴酮溶液，混匀，1小时后测量，用2 cm比色杯以水调节零点，用上海美析723N可见分光光度计于波长490 nm处测吸光度，标准各点减去零管吸光值后，绘制标准曲线或计算直线回归方程，试样吸光值与曲线比较或代人方程求出含量。
 
      2磷
 
食物中的有机物经酸氧化，使磷在酸性条件下与钼酸铵结合生成磷钼酸铵。此化合物被对苯二酚、亚硫酸钠还原成蓝色化合物——钥蓝。用上海美析723N可见分光光度计在波长660 nm处测定钥蓝的吸收光值。
1、15%硫酸溶液:    2、钥酸铵溶液:1g/200ml,用15%硫酸溶液稀释。
3、亚硫酸钠溶液:20g/100ml,临时配制，否则可使钥蓝溶液发生混浊.
4、磷标准使用液（10.0ppm）：
吸取0.625，1.25，2.5，3.75，5，6.25 ml磷标准使用液(相当于含磷量0，5,10,20,30,40,50ug)分别置于25mL具塞试管中。
准确吸取试样测定液2.5mL及同量的空白溶液，分别置于25ml具塞试管中。
依次加人2.5mL钼酸溶液摇匀，静置几秒钟。加人1.25 ml亚硫酸钠溶液，1.25 mL对苯二酚溶液，摇匀。加水至刻度，混匀。静置30分钟以后，在分光光度计660 nm波长处测定吸光度。以测出的吸光度对磷含量绘制标准曲线。
 
     3镍
 
试样中的镍用稀酸提取后，在强碱性溶液中以过硫酸铵为氧化剂，镍与丁二酮杇形成红褐色络合物，与标准系列比较定量。
国标是非消化处理的，是不是称多点就可以了，但又考虑消化时间可能太长。
1.丁二酮圬(C4H3N202,)一乙醇溶液(10g/L):      2 酒石酸钾钠溶液(500 g/L)：
3.氢氧化钠溶液(100g/L):                4.过硫酸铵溶液(60g/L):临用现配,
5、镍标准使用液（1.0ug)：
吸取 0,1，2，4，6，8，10，12，14，16ml镍标准使用液，分别置于25mL具塞比色管中。
吸试样多少？
于试样及标准管中分别依次加人1.25mL酒石酸钾钠溶液,3.75mL氢氧化钠溶液,1.25mL过硫酸铵溶液，混匀，放置3 min。再各加人0.5 mL丁二酮圬一乙醇溶液，加水至25mL,混匀。放置15 min后，用3cm比色杯，以水调节零点，于上海美析723N可见分光光度计波长470 nm处测吸光度，绘制标准曲线比较。
 
       4微波消解——分光光度法测定大豆中的硼量
 
分别吸取0、0.5、1.5、2.5、3.5、5 、6 、7.5mL 硼标准使用液, 于25mL 比色管中；
加5mL 乙酸铵缓冲溶液, 加2.5 mL 甲亚胺溶液, 混匀, 加水至刻度, 摇匀。放置1 h , 于上海美析723N可见分光光度计420 nm 处,测量吸光度。
试样用(1+1)HN3·H2O 溶液调节pH 至6.5 左右。
1、硼标准使用液(5.0ppm):                 2、氨水1+1：
3、乙酸铵缓冲溶液(pH 6.7): 取115 g 乙酸铵, 稀释到500mL , 再加入33.5g EDTA , 混匀.
4、甲亚胺溶液(9.0 g/L): 现配.称取1.8g 甲亚胺和4 g抗坏血酸, 于200mL 水中, 微热溶解。
 
      水质硼的测定——甲亚胺-H 酸光度法
 
本方法的检出浓度为 0.03ppm， 测定上限为5.0ppm(相当于10.0ppm的 HBO2) 可用于饮用水，地面水中硼的测定。锡、碲、汞与显色试剂生成白色沉淀，铝铍钛锆钒镓钼(VI)生成黄色，铜、铬生成棕黄色，铁(III) 铁(II)均对测定有干扰，可用EDTA加以掩蔽，钾钠的存在会减缓反应的速度但可延长反应时间，在6h 后再进行测定而消除干扰。
原理
在pH5.2 的盐酸和乙酸铵缓冲溶液中，硼与甲亚胺-H 酸生成可溶于水的甲亚胺H-硼酸棕黄色化合物，其最大吸收波长在410~420nm 处，由于显色速度慢，6h后发色完全，该化合物在30h内稳定。
试剂：
1、乙酸铵水溶液500g/L ：   2、1+4 盐酸溶液:40ml稀释至200ml   
3、EDTA 饱和溶液: 常温下溶解度是0.2g/L, EDTA二钠盐的溶解度较大，在22℃时，每100毫升水中可镕解11.1克，此溶液的浓度约为0.3moL/L-1。由于EDTA二钠盐水溶液中主要是H2Y2-，所以溶液的pH值接近于4.42。其溶解度比较小 受温度影响比较大长时间存放可认为其溶解度不变， 一般来说是用其钠盐酸化后制得饱和溶液。
4、硼标准使用液（10ppm）：
5、甲亚胺-H 酸显色剂：准确称取0.50g 甲亚胺-H 酸和2g 抗坏血酸溶于100mL 去离子水中，现用现配。
测定：
准确移取HBO2标准使用液0 、0.1、0.3、0.625、1.25、2.5、7.5、15ml分别移入25ml比色管；
分别加入0.50mL EDTA 饱和溶液，2.5mL盐酸溶液(1+4) ，5.0mL 乙酸铵溶液，摇匀后准确加入6.00mL 甲亚胺-H 酸显色剂，摇匀并用去离水稀释至标线，摇匀。
测量静置暗处6h后，用10mm 比色皿于上海美析723N可见分光光度计于420mm 波长处以空白试验溶液作参比测定吸光度
注意事项
(1) pH 对显色反应有影响适宜的pH 范围在5.2~5.8
(2) 显色剂甲亚胺-H 酸易氧化故应保存在有塑料压盖的棕色瓶中试剂现用现配同时加入抗坏血酸
防止氧化
(3) 当HB02 浓度在6.0mg/L 时，在50mL试液中加入6.0mL 的显色剂是最佳的络合比。
(4) 硬质玻璃中常含有硼 试样的预处理和显色操作不能用玻璃器皿所使用的玻璃器皿不应与试样溶液作长时间接触，用其他玻璃器皿时应先进行全程序空白试验用扣除空白的方法以消除玻璃器皿的影响
(5) 配制试剂用的水均需用石英蒸馏器重蒸馏过的水或用去离子水。
 
      5分光光度法测定白花蛇舌草中的钛含量
 
准确移取10ppm 的钛标准使用液0, 1, 2，3, 4, 5 mL 分别置于25 mL 容量瓶中,
各加1∶1 盐酸10mL、10% 抗坏血酸0.5 mL , 摇匀, 各加2% 二安替比林甲烷5mL , 用水稀释至刻度, 摇匀静置30 min 。波长为383 nm.
    样品加10% 抗坏血酸至完全褪色。加2% 二安替比林甲烷5mL , 用水稀至刻度, 摇匀。
1、钛标准使用液（10ppm）；        2、盐酸溶液1 mol/L：
3、二安替比林甲烷溶液2%: 准确称取10.0g 二安替比林甲烷粉末, 用1 mol/L 的盐酸溶液溶解并定容至500 mL。
 
       6水中微量硅的硅钼蓝光度法测定
 
硅钼蓝光度法测定硅, 一般在较高酸度下正硅酸与钼酸铵形成β型黄色硅钼杂多酸, 用还原剂还原成蓝色硅钼蓝, 在上海美析V723N可见分光光度计于波长810～820nm 进行光度法测定。目前, 已知的还原剂种类很多, 且各有优缺点, 如氯化亚锡、硫酸亚铁铵, 还原速度快、灵敏度高, 而稳定性差; 抗坏血酸, 硅钼蓝很稳定, 而还原速度太慢;硫酸亚铁和草酸混合作还原剂, 混合液稳定时间短; 胺基萘酚磺酸, 硅钼蓝稳定时间虽长, 但易产生沉淀而还原能力降低; 米吐尔-Na 2SO3 作还原剂易产生沉淀, 还原速度较慢且不稳定。本文研究和配制了甲醛合次硫酸氢钠和亚硫酸钠混合液, 作为水中微量硅的(硅钼蓝) 光度法测定的还原剂, 实验证明其稳定性、还原能力、灵敏度、准确度均较好, 还原剂可保存时间较长。
标准硅使用液（20ppm）:
钼酸铵溶液: 称取7.2 g 钼酸铵于50mL 烧杯中, 加10mL 蒸馏水加热溶解, 趁热慢慢把它加入5mL浓硫酸和11mL 浓硝酸中, 搅拌均匀, 稍冷后用水稀释至30mL, 如有浑浊, 放置过夜后过滤.
酒石酸溶液:21g/30ml
甲醛合次硫酸氢钠(还原剂) 溶液: 称取1.50 g 甲醛合次硫酸氢钠和4.0 g 亚硫酸钠于烧杯中, 加蒸馏水溶解至30mL, 贮于棕色带滴管小瓶中。
测定：
准确吸取硅标准使用液0，0.2，0.5，0.7，0.9，1.2，1.5 mL 于25mL 比色管中,
加入0.2ml钼酸铵, 摇匀, 放置4～5min,然后加入0.15ml酒石酸, 摇匀, 放置2min, 再加入0.4ml还原剂, 用蒸馏水稀至刻度, 摇匀, 置于沸水浴中加热3～5min, 取出流水冷却至室温, 在上海美析V723N可见分光光度计于波长810～820nm 和1mL 比色皿中, 用试剂(或蒸馏水) 作参比,测其吸光度A值。
 
       光度法同时侧定磷和硅的研究
 
磷和硅与钼酸铵都能生成黄色配合物, 此配合物与还原剂如能同时被还原为钼蓝, 但草酸能迅速破坏磷钼黄, 且实验表明, 在0～2ppm范围内, 磷钼蓝和硅钼蓝的吸光度加合性良好。故在一定条件下, 先测出磷、硅都存在时的吸光度, 再在相同条件下, 加入草酸,
测出硅钼蓝的吸光度, 二者之差即为磷钼蓝的吸光度, 然后分别在其相应的工作曲线上查出对应的磷和硅的含量。
钼酸铵溶液(2.5﹪)：
NaF(0.24﹪)-SnCL2(0.2﹪):2.4g NaF/100ml水，再加0.2g SnCL2,当天使用。
草酸溶液（1﹪）：
硫酸（1mol/L）：
磷标准使用液（10ppm）
硅标准使用液（10ppm）
 
吸0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml的标准使用液于25ml比色管中，
加入1.2ml硫酸（1mol/L）,2.5ml的钼酸铵溶液, 沸水浴加热30秒, 10ml NaF(0.24﹪)-SnCL2(0.2﹪),冷却后稀释至刻度，摇匀。用1cm比色皿, 上海美析V723N可见分光光度计于690nm处, 以试剂空白为参比测量吸光度.
 
           7铝
 
试样经处理后，三价铝离子在乙酸一乙酸钠缓冲介质中，与铬天青S及溴化十六烷基三甲胺反应形成蓝色三元络合物，于640nm波长处测定吸光度并与标准比较定量。
1、1%(体积分数)硫酸:0.1ml稀释至10ml.
2、乙酸一乙酸钠溶液:称40.8g乙酸钠溶于540mL水中，加3.12ml冰乙酸，调pH至5.5，用水稀释至600mL,
3、铬天青S溶液(0.5 g/L):
4、溴化十六烷基三甲胺溶液(0.2 g/L):0.04g/200ml ,必要时加热助溶。
5、抗坏血酸溶液（10g/L）:临用时配。
6、铝标准使用液（1.0ppm）：
应保证试样溶液中含1﹪硫酸.
吸取 0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,6.0m L铝标准使用液(相当于含0, 0.5, 1.0,2.0,4.0,6.0ug)分别置于25mL比色管中，依次向各管中加人1mL 1%硫酸溶液。
吸取1.0 mL消化好的试样液，置于25mL比色管中。
向标准管、试样管、试剂空白管中依次加人8.0 ml乙酸一乙酸钠缓冲液,1.0 ml抗坏血酸溶液，混匀，加2.0 mL溴化十六烷基三甲胺溶液，混匀，再加2.0mL铬天青S溶液，摇匀后，用水稀释至刻度。室温放置20min后，用1cm比色杯，于分光光度计上，以零管调零点，上海美析V723N紫外可见分光光度计于640 nm波长处测其吸光度，绘制标准曲线比较定量。
 
             8锌 ----双硫腙比色法(一次提取)
 
样品经消化后,在pH4.0～5.5时,锌离子与双硫腙形成紫红色络合物,溶于四氯化碳，加入硫代硫酸钠，防止铜、汞、铅、铋、银和镉等离子干扰，与标准系列比较定量。
二：试剂：
1.乙酸钠溶液(2 mol/I):称取68 g乙酸钠(CH,COONa·3H,O)，加水溶解后稀释至250 mL,
2.乙酸(2mol/L):量取10.0 mL冰乙酸，加水稀释至85mL,
3.乙酸一乙酸盐缓冲液:乙酸钠溶液(2 mol/L)与乙酸(2 mol/L)等量混合，此溶液pH为4. 7左右。用二硫腺一四氯化碳溶液(0. 1 g/L)提取数次，每次10 mL,除去其中的锌，至四氯化碳层绿色不变为止，弃去四氯化碳层，再用四氯化碳提取乙酸一乙酸盐缓冲液中过剩的二硫踪，至四氯化碳无色，弃去四氯化碳层。
4.硫代硫酸钠溶液(250 g/L):乙酸钠溶液(2 mol/L)与乙酸(2 mol/L)等量混合，此溶液pH为4. 7左右。用二硫腺一四氯化碳溶液(0. 1 g/L)提取数次，每次10 mL,除去其中的锌，至四氯化碳层绿色不变为止，弃去四氯化碳层，再用四氯化碳提取乙酸一乙酸盐缓冲液中过剩的二硫踪，至四氯化碳无色，弃去四氯化碳层。
5. 1:1氨水
6.甲基橙指示液(2 g/L):称取0.2 g甲基橙，用乙醇(20%)溶解并稀释至100 Ml
7.盐酸(2 mol/L):量取10 mL盐酸，加水稀释至60 mL,
8.锌标准使用液（1.0ug）:
10. 二硫踪一四氯化碳溶液(0.01g/L)。
    吸取5.0～10.0mL定容的消化液和相同量的试剂空白液, 分别置于25mL比色管中；　　
   吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL锌标准使用液(相当0、1、2、3、4、5μg锌),分别置于25mL比色管中。
于样品消化液、试剂空白液及锌标准液中各加1滴甲基橙指示液，用氨水调至由红变蓝，再各加5mL乙酸-乙酸盐缓冲液及1mL硫代硫酸钠溶液混匀后, 各加10.0mL0双硫腙-四氯化碳溶液，定容至25ml.剧烈振摇4min，静置分层，经脱脂棉将四氯化碳层滤入1cm比色杯中,以四氯化碳调节零点,于上海美析V723N可见分光光度计波长530nm处测吸光度,绘制标准曲线比较。
 
         锌试剂- 环己酮分光光度法测定乳制品奶粉中的锌
 
吸取0、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0、15.0ml锌标准液；
各加入2滴酚红指示剂用氢氧化钠(40 g/L)溶液调至红色,再用盐酸( 1+50)调至黄色,加入0.5克抗坏血酸, 5.0ml缓冲液, 2.0 ml氰化钾溶液(10 g/L)和3.0 ml锌试剂溶液再加入1.5 ml环己酮。混匀,放置15min用1 cm 比色皿,以试剂空白为参比于上海美析V723N可见分光光度计620 nm波长测定吸光度。
1、酚红的乙醇溶液(1 g/L)：
2、氢氧化钠(40 g/L)：        3、盐酸(1+50)：           4、抗坏血酸
5、缓冲液：称取42 g粒状氢氧化钠,溶于水, 加入155 g 硼酸, 溶解后再加纯水至500 ml;所用试剂均为分析纯,实验用水为纯水。
6、氰化钾溶液(10 g/L)：            7、锌标准使用液（10.0ppm）：
8、锌试剂溶液：紫棕色结晶性粉末。溶于乙醇和碱，溶于氢氧化钠呈红色，不溶于水。遇锌生成蓝色化合物，稀时为溶液，浓时为深蓝色沉淀。
 
      9微波消解- 紫外分光光度法测定水中总氮
 
取一定量水样于聚四氟乙烯密封消解罐中, 加水至25 mL, 摇匀。
分别取0.、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、12.0、13.0、15.0 mL氮标准使用液于聚四氟乙烯密封消解罐中, 加水至25 mL, 摇匀。
依次加入0.50 mL H2O2 , 0.50mL 9 mol/L硫酸溶液, 加盖密封后于微波消解炉中10档加热8 min, 冷却至室温。注入10 mm石英比色皿中, 分别在上海美析UV762紫外可见分光光度计的220和275 nm处测定其吸光度, 用双波长紫外分光光度法进行总氮测定。氮含量在0.024 2～9.60ppm之间时与吸光度成线性关系,以去离子水代替试样做空白试验。
过氧化氢是用于消解水中的有机物质包括含氮有机物的, 因此其用量是一个重要的控制因素。实验发现, 在过氧化氢用量为0.40～0.80 mL之间吸光度基本保持不变,
酸性条件下, 过氧化氢具有较强的氧化性; 但酸性过强, 又不利于NH4+ 转化为NO3- 。
1、氮标准使用液: 20 mg/L硝酸钾标样;
2、硫酸溶液（9 mol/L;）
3、过氧化氢溶液（0.3 g/mL）;         
4、本实验用水均为无氨水
 
       10氟——灰化蒸馏— 氟试剂比色法
 
试样经硝酸镁固定氟，经高温灰化后，在酸性条件下，蒸馏分离氟，蒸出的氟被氢氧化钠溶液吸收，氟与氟试剂、硝酸镧作用，生成蓝色三元络合物，与标准比较定量。
本方法所用水均为不含氟的去离子水，试剂为分析纯，全部试剂贮于聚乙烯塑料瓶中。
1 丙酮:需500ml.
2 盐酸(1+11):取10mL盐酸，加水稀释至120mL.
3 乙酸钠溶液(250g/L)：         4 乙酸溶液(1mol/L):取3ml,稀释至50mL.
5.氢氧化钠溶液(40g/L)：
6 茜素氨羧合剂溶液: 现配。称取0.19 g茜素氨羧络合剂，加少量水及氢氧化钠溶液(40 g/L)使其溶解，加0.125g 乙酸钠，用乙酸溶液调节pH为5.0(红色)，加水稀释至500ml。
7 硝酸镁溶液(100 g/L):
8 硝酸镧溶液: 现配。称取0.11 g硝酸斓，用少量乙酸溶液溶解，加水至约225 ml，用乙酸钠溶液(250 g/L)调节pH为5.0，再加水稀释至250mL。
9 缓冲液(pH4. 7):称取30 g无水乙酸钠，溶于400 mL水中，加22 mL冰乙酸，再缓缓加冰乙酸调节pH为4. 7，然后加水稀释至500mL.
10 氢氧化钠溶液(100 g/L):
11 酚酞一乙醇指示液(10 g/L):
12 硫酸(2+1):
13、氟标准使用液（5.0ppm）：
称取混匀试样5.00g (以鲜重计)，于30m1坩埚内，加5.0 m L硝酸镁溶液和0.5m L氢氧化钠溶液(100 g/L)、使呈碱性，混匀后浸泡0.5 h，置水浴上蒸干，再低温炭化，至完全不冒烟为止，移人马弗炉中，600度灰化6h，取出，放冷。
于坩埚中加10m L水，将数滴硫酸(2十1)慢慢加人坩埚中，防止溶液飞溅，中和至不产生气泡为止。将此液移人500mL蒸馏瓶中，用20mL水分数次洗涤坩埚，并入蒸馏瓶中。
于蒸馏瓶中加60mL硫酸(2+1)，数粒无氟小玻珠，连接蒸馏装置，加热蒸馏。馏出液用事先盛有5 mL水、7滴~20滴氢氧化钠溶液(100 g/L)和1滴酚酞指示液的50mL烧杯吸收，当蒸馏瓶内溶液温度上升至190℃时停止蒸馏(整个蒸馏时间约15 min-20 min),
取下冷凝管，用滴管加水洗涤冷凝管3次~4次，洗液合并于烧杯中。再将烧杯中的吸收液移人50 mL容量瓶中，并用少量水洗涤烧杯2次~3次，合并于容量瓶中。用盐酸(1+11)中和至红色刚好消失。用水稀释至刻度，混匀。
    吸取0,1.0,3.0,5.0,7.0,9.0 mL氟标准使用液(相当0,1,3，5,7，9ug氟) 于25 mL带塞比色管中。
    分别吸取试样蒸馏液各10.0 mL于25 mL带塞比色管中。
各加2.OmL茜素氨羧络合剂溶液、3.0 mL缓冲液、6.0 mL丙酮、2.0 m L硝酸镧溶液，再加水至刻度，混匀，放置20m in，以3cm比色杯(参考波长580nm)用零管调节零点，测各管吸光度，绘制标准曲线比较。
 
葡萄糖氧化酶法
1.原理
葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下产生葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下使邻联甲苯胺生成蓝色物质，此有色物质在625nm 波长下与葡萄糖浓度成正比。通过测定蓝色物质的吸光度可计算样品中葡萄糖的含量。
2.适用范围
适用于谷类、乳类、饮料、酒类等食物样品和血液样品。检出量为0.02 mg。
3.仪器
上海美析722分光光度计。
4.试剂：
除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。
（1） 乙醇。
（2） 40% 三氯乙酸：称取40g 三氯乙酸，用水溶解并稀释至100ml。
（3） 2 mol/L NaOH 溶液：称取8g NaOH， 用水溶解并稀释至100ml。
（4） 1 % 邻联甲苯胺溶液：称取0.1 g 邻联甲苯胺溶解于10 ml无水乙醇中，倒入棕色瓶中，4 ℃ 冰箱保存。
（5） 乙酸缓冲液 （pH 5.0）：称取14.28 g 乙酸钠 （CH3COONa•3H2O）溶于水中，加入2.7 ml 冰乙酸，并调节pH 5.0， 用水定容至1 L。
（6） 葡萄糖氧化酶溶液：称取一定量的葡萄糖氧化酶（Sigma 公司）用水溶解，使酶含量为100 U/ml。4 ℃ 冰箱保存一周。
（7） 过氧化物酶溶液： 0.010 g 辣根过氧化物酶溶于10 ml 水中，4 ℃ 冰箱保存一周。
（8） 酶溶液：取100 ml 乙酸缓冲液，分别加入邻联甲苯胺溶液、葡萄糖氧化酶溶液、过氧化物酶溶液各1 ml，混匀。4℃ 冰箱可保存七周。
（9） 酶空白液：取100 ml 乙酸缓冲液，分别加入邻联甲苯胺溶液、过氧化物酶溶液各1 ml，混匀。4℃ 冰箱保存一周。（注意酶空白液中不含葡萄糖氧化酶）
（10） 葡萄糖标准液：将葡萄糖标准品（纯度大于99%）于80 ℃干燥至恒量。精确称取0.050 g，用水移入100 ml 容量瓶中，定容至刻度线。相当于浓度为0.5 mg/ml。
5.操作步骤：
5.1样品处理：
（1）固体样品：称取0.5～5g已粉碎的样品于锥形瓶中，加入50ml水后沸水浴15min。冷却后，转移至100ml容量瓶中并用水定容至刻度。反复摇动混匀样品，过滤，弃初始几滴滤液。收集滤液。如果滤液澄清，可直接或经进一步稀释后用于测定。如果滤液浑浊，吸取20ml滤液转移至另一容量瓶中，加入无水乙醇至刻度。混合后静置至少30min。过滤，滤液用于测定。
（2） 液体样品，寡糖、淀粉等碳水化物水解液：吸取2～10ml样品或水解液，加入4倍量乙醇，混和。静置至少30min，过滤后滤液备用。（如果过滤后滤液仍浑浊，或样液体积过少，可3000rpm离心15 min，上清液备用。）
（3） 新鲜牛乳等样品：吸取0.5～2ml 样品，用水稀释，加入3ml 40% 三氯乙酸溶液。用水定容至100ml，过滤。吸取5ml 滤液，用2 mol/L NaOH 调节pH至中性，用水定容至10ml，备用。
（注：样品处理中80% 乙醇的用途是沉淀不溶性多糖和部分蛋白质，40% 三氯乙酸用于沉淀蛋白。）
5.2测定：标准管和样品测定管，按下表所列操作（单位：ml）
　 
试  剂        标准空白管        葡萄糖标准管        样品空白管        样品测定管
葡萄糖标准液        ——        0.1～0.5        ——        ——
样品提取液        ——        ——        0.5        0.5
水        0.5        补至0.5        ——        ——
酶溶液        5        5        ——        5
酶空白液        ——        ——        5        ——


上述试剂混合后37℃ 水浴反应 15 min， 625 nm 测定吸光度值。
（注意：葡萄糖与酶溶液的成色反应与反应时间密切相关，如反应时间过长，溶液颜色会由蓝转变成灰色，并慢慢产生沉淀，所以反应时间应严格控制好。）
6.计算
根据吸光度值求出葡萄糖标准曲线的回归方程，采用插入法求出样品测定管中葡萄糖含量，再根据稀释定容体积和称样量，计算出样品中葡萄糖含量。
计算公式：
X= (As-Ab)×V×F×0.1
0.5×m
式中: 
X——样品中葡萄糖含量，g/100g;
As—— 由标准回归方程求出的样品测定管中葡萄糖含量，mg；
Ab——由标准回归方程求出的样品空白管中葡萄糖含量，mg；
V——样品定容体积，ml；
F——稀释倍数
0.5——测定时吸取样品提取液的体积，ml；
m——样品质量，g；
0.1——将mg/g转换成g/100g的系数。
7.注意事项
（1） 此方法中的酶溶液只能和葡萄糖反应，特异性强，灵敏度高。
（2） 如果样品提取液为无色，无需做样品空白。但是有些样品颜色很深，如饮料、菌藻类食物，或样品提取液浑浊，往往干扰测定结果但又难以去除，所以测定这类样品时需做样品空白管以减少干扰。
 
此处介绍蔬菜中维生素K1的测定方法（HPLC法）和食物及饲料中水溶性维生素K3（甲萘醌）的测定方法
一、蔬菜中维生素K1的测定方法-HPLC法
1.原理
蔬菜中的维生素K1经有机溶剂提取后，经失活的磷酸盐处理过的氧化铝色谱柱进行净化，再用液相色谱法将维生素K1分离并进行定性定量测定。
2.适用范围
本标准适用于各类蔬菜、绿色植物及其干制品中维生素K1的测定。
3. 仪器：
（1） 实验室常用设备
（2） 打碎机
（3） 202-R型恒温干燥箱
（4） 色谱柱：为0.8cm×30cm的玻璃柱，底端收缩变细，并装有活塞，活塞上约1 cm处有一玻璃筛板，筛板孔径为16～30μm，柱上端膨大为容积约30ml的储液池。使用前需干燥
（5） 旋转蒸发器
与旋转蒸发器配套的旋转蒸发瓶：具塞，圆底，容积为150ml。
（6） 恒温水浴锅
（7） 高纯氮气
（8） 高速离心机
与高速离心机配套的小离心管：具塞，容积为1.5～3.0ml。
（9） 上海美析UV762紫外分光光度计
（10） HPLC：高效液相色谱仪，带紫外检测器
4.试剂
除特殊说明实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯，有机溶剂使用前需重新蒸馏。
3.1 无水硫酸钠：使用前需在150℃的烘箱内烘烤4～8小时，以去除水分。
3.2 0.14mol/L Na2SO4溶液：称取20g无水硫酸钠，用蒸馏水溶解后定容至1L。
3.3 丙酮：分析纯。
3.4 石油醚：沸程30～60℃，分析纯。
3.5 0.6mol/L碘化钾溶液：称取10g碘化钾，用蒸馏水溶解定容至100ml。
3.6 5g/L淀粉液：称取0.5g可溶性淀粉，用水溶解定容至100ml。
3.7 乙醚：分析纯。不含过氧化物。
（1） 过氧化物的检查方法：用5ml乙醚加1ml0.6mol/L碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色。或加4滴5g/L淀粉液，水层呈蓝色。则该乙醚含有过氧化物需处理后使用。
（2） 去除过氧化物的方法：重蒸时瓶中加一段纯铁丝，弃去10%初馏液和10%残留液。
3.8 洗脱液：石油醚+乙醚（97+3）。
3.9 甲醇：优级纯。
3.10 正己烷：优级纯。
3.11 磷酸氢二钠：分析纯。
3.12 中性氧化铝：100～200目。
3.13 氧化铝的处理：
（1） 磷酸盐处理氧化铝：取250g中性氧化铝，20g磷酸氢二钠，1.6L蒸馏水，放入容积为2L的锥形瓶中沸水浴30min，不时摇动或搅拌。冷却，倒掉上层液体（包括悬浮的细小颗粒），然后用布氏漏斗抽滤。将残留物转至平底玻璃皿中，于150℃干燥箱中烘烤3～5h至两次称量相差3g以下，烘烤过程中不时搅拌，以避免结块，冷却后放入干燥器中保存。
（2） 失活处理氧化铝：使用前，将磷酸盐处理的氧化铝，加入具塞锥形瓶中。每100g氧化铝加9.0ml去离子水，盖紧瓶塞，蒸汽浴或80℃干燥箱加热3～5min，剧烈摇动锥形瓶，使氧化铝可以自由流动，无结块。冷却，静置30分钟，使水分分布均匀。
（3） 验证处理过的氧化铝：取标准应用液1.0ml，用氮气吹干，再用石油醚溶解定容至1.0ml。然后按5.3装柱，将标准溶液加入柱上，按5.4净化步骤进行柱色谱，用旋转蒸发瓶收集洗脱流出液，浓缩，氮气吹干，用正己烷定容至1.0ml，HPLC测定，记录峰面积或峰高（A）。另取标准应用液直接测定，记录峰面积或峰高（Ar）。将A与Ar进行比较，其值在0.97～1.03之间（A/Ar），则说明柱效较好，氧化铝处理合格。否则需重新进行失活处理。如果再次验证比值仍不能达到0.97，则需重新制备氧化铝。
3.14 维生素K1标准：Sigma公司，纯度>98%。
3.15 标准贮备液：精确称取50.0mg维生素K1标准，用正己烷溶解定容至50.0ml，即1.0mg/ml。将储备液分装成安瓿，冷冻保存。
3.16 标准工作液：取标准贮备液， 用正己烷准确稀释50倍, 即20.0μg/ml。
标准工作液的标定：取标准应用液测定紫外吸光值，波长248nm，比色杯厚度1cm，以正己烷为空白，测定3次，取平均值，按下式计算标准应用液浓度。 
X1 =        A        ×M ×103        ……………………………………(1)
        E                
式中： X1 -- 维生素K1标准应用液浓度，μg/ml；
A -- 标准应用液平均紫外吸光值；
E -- 摩尔消光系数，20,000；
M -- 维生素K1分子量450.7；
103 -- 换算成μg/ml的换算系数。
5.操作步骤
所有操作均需避光进行
5.1 样品处理
（1） 新鲜蔬菜：拣净去杂物，将可食部洗净，擦去表面水分，切碎，用打碎机制备成匀浆。
（2） 干制植物性样品：磨碎,过60目筛。
5.2 样品提取
（1） 称取已打成匀浆的新鲜样品2～10g（维生素K1含量不低于2μg），加到具塞锥形瓶中,再加入5～10倍体积的丙酮,盖上塞子,振摇3～5min，静置1min，以下按5.3步骤操作。
（2） 称取干制植物性样品0.2～4g（维生素K1含量不低于2μg）,加到研钵中，再加入2～4倍于样品量的无水Na2SO4研磨均匀后,加入25ml丙酮,研磨3～5min，静置1min。
（注：对于细胞壁比较厚的样品，如藻类食品，可先用石英砂研磨，破坏植物组织细胞。石英砂需进行预处理，将石英砂用20目筛子过筛之后，先用浓盐酸浸泡，然后再用稀氢氧化铵浸泡，最后用蒸馏水洗至中性后在烘箱中烤干。使用时，每10g样品加3～5g石英砂于研钵中研磨。）
5.3 洗涤
将上部澄清液倒入已装有50～100ml 0.14mol/L Na2SO4溶液的分液漏斗中，残渣再用丙酮提取2～3次，每次用量不少于25ml，上清液并入分液漏斗。残渣继续用石油醚洗涤3～4次，每次用量约25ml，至洗涤液呈无色，将洗涤液倒入同一分液漏斗中，振摇1min，静置。弃水相，有机相用蒸馏水洗涤4～5遍，至水相澄清。弃水相，将有机相经无水Na2SO4脱水后转至旋转蒸发瓶中，于60℃水浴中减压蒸馏至约2ml时取下，立即用氮气吹干，用石油醚定容至2.0 ml，待净化。
5.4 装柱
取干燥色谱柱，将验证好的氧化铝浸泡于石油醚中，湿法填充于色谱柱，使氧化铝自由均匀流下，至柱高为20cm，其上端再加2 cm无水Na2SO4。打开活塞，调整流速为每秒1滴。一根色谱柱只用于一个样品测定。
5.5 色谱净化：待石油醚流至柱上端0.5cm时，加V1 ml样品提取液，当样品液流至柱平齐时，加2 ml石油醚冲洗柱壁，流下。再加10ml石油醚洗脱，2次，弃除流出液。然后，用30 ml洗脱液洗脱，用旋转蒸发瓶收集流出液。流出液于旋转蒸发器浓缩近干，取下用氮气吹干后，用正己烷定容为V2 ml。将定容液移入小塑料离心管中，5000rpm离心5min，上清液供HPLC分析。
5.6 标准工作曲线的绘制
分别取维生素K1标准应用液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0ml，加入分液漏斗中，按5.2步骤提取，浓缩定容至2.0ml。取1.0ml标准提取液按5.4步骤操作，最后定容至1.0ml，即标准工作曲线中各点维生素K1含量分别相当于5，10，20，40，60，80，100μg/ml。然后再按5.6条件进行HPLC测定，记录峰面积或峰高。以标准含量为横坐标，峰面积或峰高为纵坐标绘制标准工作曲线。
5.7 HPLC色谱分析
色谱条件（推荐条件）：
预柱ultrapack ODS，10μm，4.0mm×4.5cm。
分析柱：ultrasphere ODS，C18，5μm，4.6mm×250mm。
流动相：甲醇+正己烷（98+2）。混匀，临用前脱气。
进样量：20μl。
流速1.5ml/min。
紫外检测器：波长248nm。量程0.01～0.05。
HPLC稳定性的测定：取标准应用液连续进行6次HPLC测定，计算峰面积或峰高的平均值、标准差和RSD%，如果RSD<1%，说明仪器稳定性良好。仪器稳定后方可进行样品测定。
5.8 样品分析
取样品净化液20μl，按色谱条件进行定性、定量分析。
（1） 定性：用标准色谱峰的保留时间定性。
（2） 定量：用样品峰面积或峰高在标准工作曲线上查出其相应的维生素K1含量，或用回归方程求出其含量。


6.计算
          c×2×V2 ×100
X 2＝ ………………………………（2）
              V1 ×m
式中： X2 -- 样品中维生素K1的含量,μg/100g;
c -- 由标准工作曲线上查出或回归方程求出的维生素K1含量,μg;
2 -- 样品提取后的定容体积,ml;
V1 -- 样品净化处理时的取液量,ml;
V2 -- 样品净化后的定容体积,ml;
m -- 样品质量,g。
7. 注意事项
（1） 7.1允许差及最小检出量: 同一实验室同时或连续2次测定结果相对偏差绝对值≤10%，本法最小检出限为0.5mg。
（2） 本方法避免使用皂化处理，减少了维生素K1的破坏；利用失活的磷酸盐处理过的氧化铝进行色谱分离，通过改变洗脱液的极性使维生素K1与杂质分离，有利于高效液相色谱对维生素K1的定性及定量分析。
（3） 维生素K1具有很强的亲脂性，溶于丙酮、石油醚、正己烷、异辛烷等溶剂中，而不易溶于甲醇、乙醇等溶剂中。当样品中含有较多的水分时，如直接用石油醚或正己烷提取会使样品变粘，因此，样品需先用丙酮提取，或先用无水Na2SO4研磨，然后再用丙酮提取，可起到吸收水分的作用，进一步地破坏样品的细胞组织，使提取效果更佳。
（4） 以往的报告多选用活性硅胶或中性氧化铝做色谱柱分离维生素K1，再用极性小的有机溶剂作洗脱液。实际工作中发现，用硅胶色谱柱，洗脱流速慢，洗脱液用量大，分离时间较长；用未经处理的氧化铝色谱柱分离会出现维生素K1与干扰物分离不清的现象。当氧化铝用磷酸盐处理后，氧化铝的极性增强，使吸附较小的维生素K1易于被洗脱液洗脱出来，而且在处理后的氧化铝中加入少量水分可以提高柱效，减少维生素K1出峰拖尾的现象，缩短保留了时间，避免了因使用氧化铝造成的维生素K1可能分解的现象。
（5） 如果氧化铝色谱柱柱效良好，首先被石油醚洗脱出来的应是胡萝卜素，且柱上没有胡萝卜素黄色带扩散的现象；叶绿素及其他色素停留在色谱柱的上方没有或仅有少量位移但不影响分离效果。
（6） 洗脱液中乙醚含量的多少影响着洗脱液的极性，如果乙醚含量少，可使维生素K1的保留时间延长，反之，会使干扰物质被提前洗脱，影响净化效果。所以应严格控制洗脱液中乙醚的比例。
（7） 根据标准维生素K1紫外扫描图谱，可见维生素K1于240，248nm，260，269nm波长处有4个特征峰，其中260nm的峰最低。将标准品用HPLC测定，以260nm波长下的峰面积为1，则240nm, 248nm和269nm波长下的峰面积分别为1.15，1.23，1.09。
（8） 一般反相色谱，多用有极性的甲醇作为流动相。在甲醇中加入适量的非极性有机溶剂（如正己烷、异辛烷等），可以增加维生素K1 的溶解能力，有利于缩短保留时间，减少出峰拖尾现象。本方法选择甲醇+正己烷（98+2）作为流动相，维生素K1的保留时间为15.6±0.1min。
（9） 本方法最小检测限为0.5μg/ml，在1.0～100.0μg/ml范围内与峰面积有良好的线形关系。批间测定结果的相对标准偏差在1.3～7.1% （n=6）；回收率为90.9～106.3%。。不同实验室间测定结果表明此方法精密度、重现性较好，净化效果好，试剂价格适中。
 
总胆碱的测定
比色法
1.原理
食物中的胆碱经过碱处理提取后，通过Florisil柱色谱纯化，然后用雷纳克盐（reineckate）与胆碱反应形成粉红色的胆碱-雷纳克盐复合物，这种复合物被丙酮洗脱后，在526nm有最大吸收，其吸收值与胆碱浓度成正比。
2.适用范围
参照《Methods of Vitamin Assay》。使用于各类食物中胆碱的测定。最小检出限为0.15mg。
3. 仪器与设备
（1） 实验室常用设备。
（2） 回流提取装置。
（3） 色谱柱：为0.8cm（内径）×30cm的玻璃柱，柱上端为容积30～50ml的储液池，底端收缩变细，并装有活塞。活塞上约1 cm处有一玻璃筛板，筛板孔径为16～30μm。
（4） 上海美析723N可见分光光度计。
4. 试剂
除特殊说明外，所有试剂均为分析级，实验用水为蒸馏水。
（1） 甲醇。
（2） 氯仿。
（3） 乙酸甲酯。
（4） 丙酮：用前重蒸馏。
（5） 10% 丙酮： 取50ml丙酮溶解于450ml水中。
（6） 冰乙酸。
（7） 冰乙酸-甲醇溶液：取50ml冰乙酸和400ml甲醇混合。
（8） 饱和氢氧化钡提取液：于1000ml甲醇中加入40g无水Ba(OH)2，搅拌10min,再加入100ml氯仿，混合，使Ba(OH)2饱和，过滤去除多余的Ba(OH)2。
（9） 硅镁吸附剂（Florisil）：Sigma 公司，60～100目。
（10） 雷纳克铵（Ammonium Reineckate）饱和溶液：称取2～3g雷纳克铵，加入100ml水中，搅拌10min ,过滤去除多余的雷纳克铵。实验当日配制。
（11） 胆碱标准贮备液（5g/L）：准确称取无水氯化胆碱0.57613g，溶解于水中，并定容至100mL。冰箱保存。
（12） 胆碱标准工作液（1g/L）：准确吸取2.0ml标准贮备液，用水稀释定容至100ml。
5.测定步骤
所有操作均需避光进行
5.1 提取：称取适量样品（约含5～50mg胆碱），置于100ml具塞锥型瓶中，加入30ml提取液，边加边摇，避免结块。然后放置于76℃～80℃恒温水浴回流2～4h，回流速度为1～2滴/秒。（注：加热回流的温度应严格控制在80℃左右，否则样品易扑溅，造成损失。样品提取率与回流时间有关，回流2小时，提取率达到最高值，回流3～4小时，可以保证样品提取较完全。）冷却，样品过滤至100ml容量瓶中，反复用5～10ml冰乙酸-甲醇溶液洗涤锥形瓶和滤渣，滤液并入容量瓶中。用pH试纸测定提取液pH在2～6范围之内（必要的话可加入冰乙酸调节pH），然后用甲醇定容至刻度。
5.2 纯化
（1） 填装色谱柱：将硅镁吸附剂浸入甲醇中，湿法将硅镁吸附剂填充入色谱柱中（注：色谱柱最好经过干燥处理，否则影响洗脱液流速），至硅镁吸附剂的高度达10cm（约4g）。用甲醇冲洗色谱柱，并保持甲醇高于硅镁吸附剂顶端0.5～1cm。
（2） 柱色谱纯化：吸取一定量的提取液加到色谱柱中，打开底端活塞，使提取液靠重力作用通过色谱柱。先后用5ml，10ml甲醇洗涤色谱柱。待甲醇通过色谱柱后，依次用2份10ml乙酸甲酯，10ml冷的10%丙酮洗涤色谱柱。接着加入5ml雷纳克铵饱和溶液（雷纳克铵与吸附于色谱柱上的胆碱结合），待雷纳克铵饱和溶液完全通过色谱柱后，用2份10ml冰乙酸洗涤直至流出液清亮为止（冰乙酸的作用是洗脱未与胆碱结合的过量的雷纳克铵，应注意洗脱完全）。用15ml丙酮洗脱色谱柱上胆碱-雷纳克盐复合物的粉红色色谱带，收集洗脱液，并用丙酮定容至15ml。
5.3 比色测定：用1cm比色杯，以丙酮调节零点，于526cm波长下，测定样品吸光度，其值在标准工作曲线上查出，或通过回归方程计算出对应的胆碱含量，供计算使用。
5.4标准工作曲线：分别吸取0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml标准工作液（3.13），加至色谱柱上，按照上述样品测定步骤操作。以胆碱含量做横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。
6.计算
  C ×V1×100
X= -------- ×100
   V2 × m
式中：
X--样品中胆碱的含量，（mg/100g）；
C--从标准工作曲线或回归方程中查到的胆碱含量，mg；
V1--样品提取液的总体积，ml
V2--纯化用提取液的体积，ml；
m--样品质量，g
7.注意事项
（1） 同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值＜10%。
（2） 硅酶吸附剂填充的高度关系到洗脱液的用量，如果填充过高，则应加大洗脱液用量，以保证胆碱的纯化和完全洗脱。
（3） 纯化过程中冰乙酸的作用是将不能与胆碱形成复合物的多余雷纳克铵盐洗脱，丙酮则是洗脱胆碱-雷纳克铵复合物，如果这两步洗脱不完全，均影响胆碱的测定，所以必要时应增加冰乙酸和丙酮的用量以保证测定结果。